Phương pháp kiểm tra tổng số vi khuẩn lactic do nghành y tế ban hành

Ngày đăng: 16-05-2007 | Chuyên mục: Câu hỏi - Giải đáp | Tác giả:

Hỏi: Hiện nay tôi đang sử dụng phương pháp kiểm tra tổng số vi khuẩn lactic do nghành y tế ban hành nhưng kết quả không khả quan vậy hiện nay có phương pháp kiểm tra nào khác xin quí vị chỉ gíup cho tôi. (tôi kiểm tra sản phẩm Rượu vang)

lê thanh an andalatbeco@yahoo.com

NGUYÊN LÝ:

Sử dụng kỹ thuật cấy láng, đếm khuẩn lạc nghi ngờ  trên môi trường thạch MRS sau khi ủ vi hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1^o C trong 48 giờ. Xác định số khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Lactic ở từng đậm độ.

Sau đó, để khẳng định là vi khuẩn Lactic tiến hành nhuộm gram, thử nghiệm oxidase và catalase.

I. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ:

1. Dụng cụ, thiết bị chính:

- Tủ ấm 37^oC

- Máy đồng nhất mẫu

- Bình nuôi cấy kị khí

- Túi tạo khí trường vi hiếu khí

- Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc

- Đĩa petri đường kính 90 mm, hoặc 110mm

- Que cấy đầu niken hoặc platin (Không dùng que cấy có đầu bằng sắt hoặc bằng crom, vì sự oxi hoá bề mặt có thể gây hiện tượng dương tính giả).

2. Môi trường, thuốc thử:

- Nước pepton

- Thạch MRS (de Man, Rogosa, Sharpe agar with Sorbic Acid)

- Dung dịch oxy già (H₂O₂) 3%

- Dung dịch Tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1% (dung dịch thử  oxydase)

- Dung dịch acid sorbic

- Bộ thuốc nhuộm Gram.

 II. CHUẨN BỊ  MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ:

1. Chuẩn bị môi trường:

  Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và thuốc thử  được pha chế theo công thức và hấp tiệt trùng theo hướng dẫn cho từng loại môi trường trong phần phụ lục I.

2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử:

a. Chuẩn bị mẫu:

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.

b. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử  10^-1

Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 90ml nước pepton. Lắc đều 2-3 phút, thu được dung dịch mẫu thử  10^-1.

c. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^-2, 10^-3, 10^-4 …

- Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử 10^-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước pepton. Lắc đều trong 2-3 phút, thu được dung dịch 10^-2.

- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10^-3, 10^-4 ...

III. TIẾN HÀNH XÁC ĐỊNH:

Bước 1 : Nuôi cấy mẫu

- Ghi ký hiệu mẫu và nồng độ dung dịch mẫu thử lên đĩa thạch MRS.

- Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử ở từng đậm độ nhỏ lên bề mặt đĩa thạch MRS đã được hong khô. Dùng que láng vô trùng,  láng đều sao cho dung dịch mẫu thử được phân bố đều trên mặt thạch. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ . Mỗi đậm độ pha loãng phải được nuôi cấy trong 2 đĩa thạch MRS và 1 pipet vô trùng riêng.

- Để các đĩa thạch trên mặt phẳng ngang trong vòng 15 phút để dung dịch mẫu thấm hết vào bề mặt thạch. Sau đó lật sấp các đĩa và để vào tủ ấm 3O ± 1^o C ở điều kiện vi hiếu khí trong 48 giờ.

 Lưu ý:  Để tạo khí trường vi hiếu khí tiến hành như sau:

Cách 1: Sử dụng túi tạo khí trường vi hiếu khí.

Với bình nuôi cấy có dung tích 3-3,5 lít cần 1 túi, bình nuôi cấy có dung tích 7– 8 lít cần 2 túi. Mỗi túi tạo khí sẽ được cho vào 10 ml nước cất hoặc nước máy, sau đó cho ngay túi tạo khí vào bình nuôi cấy rồi đậy nắp lại thật chặt, rồi để vào tủ ấm 30⁰C trong 48 giờ.

Cách 2: Sử dụng bình nến

Các đĩa thạch MRS được cho vào bình nuôi cấy, một ống nước và một ngọn nến cũng được cho vào bình, sau đó đậy nắp thật chặt rồi để vào tủ ấm 30⁰C trong 48 giờ.         

Bước 2: Xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic ở từng đậm độ

- Chọn các đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để sơ bộ đọc kết quả.

- Đếm và ghi lại số khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Lactic ở từng đậm độ: khuẩn lạc tròn nhỏ trong bóng, màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem; hoặc khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục (dễ nhầm với khuẩn lạc nấm men); đặc biệt các khuẩn lạc toả ra mùi chua của acid.

Lưu ý: Nhìn chung khuẩn lạc của vi khuẩn Lactic có kích thước nhỏ nên cần sử dụng máy đếm khuẩn lạc để xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic.   

Bước 3: Xác định là vi khuẩn Lactic

Từ những khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Lactic tiến hành nhuộm gram, thử nghiệm oxydase và catalase (3).

a. Nhuộm Gram: vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài, dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn Lactic còn có hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi.

b. Thử nghiệm oxydase:

Đặt một miếng giấy lọc vô trùng vào đĩa petri vô trùng, hoặc lên 1 lam kính vô trùng. Nhỏ vài giọt thuốc thử  Tetramethyl - p - phenylendiamin dihydrochlorid 1% lên miếng giấy lọc. Dùng que cấy Platin hoặc que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc (tốt nhất là khuẩn lạc không quá 48 giờ), rồi mài kỹ lên phần giấy lọc đã nhỏ thuốc thử.

 Lưu ý:

- Trước khi làm phản ứng nên thử lại thuốc thử với hai chủng vi khuẩn có oxydase âm tính và oxydase dương tính đã biết tuỳ theo từng phòng thí nghiệm. Có thể dùng hai chủng chuẩn E.coli ATCC25922 (oxydase âm), Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 (oxydase dương)

* Đọc kết quả: Nếu xuất hiện màu tím sẫm ngay lập tức hoặc sau 10 giây thì là oxidase (+).

c. Thử nghiệm catalase:

Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc (tốt nhất là khuẩn lạc không quá 24 giờ) đặt lên 1 lam kính vô trùng. Nhỏ 1 giọt dung dịch oxy già (H₂O₂) 3% phủ lên khuẩn lạc.

* Đọc kết quả: Nếu thấy xuất hiện bọt khí là catalase (+).

Tiêu chuẩn xác định là vi khuẩn Lactic:

- Gram (+), hình trực khuẩn, cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn

- Oxydase (-)

- Catalase (-)  

Tính kết quả

Để xác định tổng số vi khuẩn Lactic có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Tổng số vi khuẩn Lactic có trong 1g hoặc 1ml mẫu thử (N) được tính theo công thức sau:

             ∑ C

  N = --------------------------

         V( n₁+ 0,1xn₂ )d

 Trong đó:

∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả  các đĩa đã chọn.

V:   Thể tích cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml

n₁: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

n_2: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại

d:  Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất

Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa (nếu số cần làm tròn nhỏ hơn 5 thì số đứng trước nó không thay đổi. Nếu số cần làm tròn bằng hoặc lớn hơn 5 thì số đứng trước nó tăng lên một đơn vị, tiếp tục làm tròn cho đến khi chỉ còn hai chữ số có nghĩa).

Số vi khuẩn Lactic có trong 1g hoặc 1ml thực phẩm được biểu thị bằng số thập phân từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10ⁿ (trong đó n là luỹ thừa tương ứng của 10)

Ví dụ: 1 mẫu thực phẩm kiểm tra cho kết quả:

- Đậm độ pha loãng 10^-1: 145 khuẩn lạc (đĩa1), 128 khuẩn lạc (đĩa2)

- Đậm độ pha loãng 10^-2:  65 khuẩn lạc (đĩa1), 78 khuẩn lạc (đĩa2)

- Đậm độ pha loãng 10^-3: 15 khuẩn lạc (đĩa1), 25 khuẩn lạc (đĩa2)

                     145 + 128 + 65 + 78

              N = -------------------------- = 32.545

                      0,1( 2+ 0,1x 2 )10^-1

Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên thu được 33.000 hoặc 3,3 x 10⁴ vi khuẩn Lactic / g (ml) thực phẩm.

* Lưu ý:

- Nếu 2 đĩa của đậm độ pha loãng ban đầu có ít hơn 15 khuẩn lạc thì tính kết quả theo trung bình cộng.

- Nếu 2 đĩa của đậm độ pha loãng ban đầu không có khuẩn lạc nào, thì kết quả như sau:

  + Đối với sản phẩm lỏng nhỏ hơn 1 vi khuẩn Lactic/ ml

  + Đối với sản phẩm khác nhỏ hơn 10 vi khuẩn Lactic/g